Barbara Di Castri ha studiato al Conservatorio di Firenze dove nel 1996 ha conseguito il diploma in canto a pieni voti. Successivamente si è perfezionata con Herbert Handt all'Accademia Italiana di Canto, con Leone Magiera alla Scuola di Musica di Portogruaro e con Alberto Zedda all'Accademia Rossiniana di Pesaro.
Sotto la direzione di Herbert Handt ha cantatato i ruoli protagonisti dell'Orlando e dell'Ottone di Händel. Ha debuttato nei ruoli di Rosina nel Barbiere di Siviglia a Montepulciano; Isabella nell'Italiana in Algeri e la Baronessa di Champigny nel Cappello di paglia di Firenze a Lucca sotto la direzione di Piero Bellugi e Krobilo ne L'ombra dell'asino di Richard Strauss al Piccolo Teatro del Comunale di Firenze con Massimo De Bernart.
Ha partecipato al Festival rossiniano di Bad Wildbad con la cantata La Riconoscenza di Rossini. Nella stagione 2002/03, a Musica per Roma, ha interpretato il ruolo della Strega in Hansel und Gretel di Humperdinck; al Teatro Comunale di Ferrara la Passione Secondo Giovanni di Bach; al Théâtre du Chatelet di Parigi la Mamma, la Tazza e la Libellula ne L'enfant et les sortilèges di Ravel; al Festival Spontini di Iesi Dorina ne L'impresario alle Canarie di Padre Giovanni Battista Martini.
Al Teatro Regio di Torino ha quindi cantato Garcia nel Don Quichotte di Massenet diretto da Bruno Campanella ed è stata impegnata come Pasquariello nel Don Giovanni di Gazzaniga con l'Orchestra dell'Accademia di San Giorgio di Venezia diretta da Alan Curtis.
Ha cantato Petite Messe Solennelle di Rossini nella Basilica di Santa Maria Maggiore a Roma con Gianluigi Gelmetti e La Dirindina di Giovanni Battista Martini, diretta da Arnold Bosman con la regia di Michail Znaniecki al Museo della Musica di Bologna. Ha inoltre interpretato Maddalena nel Rigoletto diretto da Daniele Gatti al Teatro Comunale di Bologna - spettacolo con cui è stata in tournée anche in Corea; Ericlea ne Il ritorno di Ulisse in patria, diretto da Ottavio Dantone nei teatri di Cremona, Como, Pavia e Ferrara; Isaura nel Tancredi sotto la direzione di Gianluigi Gelmetti e la regia di Pier Luigi Pizzi al Teatro dell'Opera di Roma e Kaled in Le Roi de Latore diretto da Marcello Viotti al Teatro la Fenice di Venezia.
Recentemente è stata impegnata a Roma, al Teatro dell'Opera e alle Terme di Caracalla, in Madama Butterfly nel ruolo di Suzuki, diretta da Donato Renzetti; a Ravenna, nel Tito Manlio di Vivaldi con Ottavio Dantone e l'Accademia Bizantina; al Festival de Bearne e al Teatro Regio di Torino, con l'Olimpiade di Vivaldi insieme all'Accademia Montis Regalis diretta da Alessandro De Marchi nel ruolo di Argene e nuovamente nel Tancredi di Rossini con Daniela Barcellona e Darina Takova al Teatro Comunale di Firenze, con la direzione di Riccardo Frizza e la regia di Pier Luigi Pizzi.
Il suo repertorio concertistico comprende Stabat Mater di Pergolesi, Messiah di Händel, Requiem di Mozart, Gloria e Magnificat di Vivaldi, Magnificat di Bach, Petite Messe Solennelle di Rossini, l'Oratorio di Natale di Saint-Saens, Te Deum di Puccini, Il Giuseppe riconosciuto di Boccherini, Requiem in sol minore di Cimarosa e Miserere di Pacini.
Prossimamente sarà impegnata a Roma con l'Accademia Nazionale di Santa Cecilia diretta da Daniele Gatti in The Rake's Progress per la regia di Lorenzo Mariani; al Théâtre des Champs Elysées a Parigi, nel ruolo di Arsace in Semiramide, diretta da Evelino Pidò; a Londra, al Lufthansa Festival con la Senna Festeggiante di Vivaldi sotto la direzione di Ivor Bolton; e al Teatro Regio di Torino, nella Lucrezia Borgia.
Barbara Di Castri ha inciso per Dongiovanni, Kikko Records, Tactus e Amadeus.